声明

本文是学习GB-T 34776-2017 T4 DNA连接酶 酶活及杂质检测方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们

1 范围

本标准规定了T4 DNA 连接酶的活力、杂质的检测方法。

本标准适用于作为分子生物学研究用的T4 DNA 连接酶。

2 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

YY/T 0087 电泳装置

YY/T 0657 医用离心机

JJG 646 移液器检定规程

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

DNA 连接酶 DNA ligase

一种封闭 DNA 链上的缺口酶，借助 ATP 或 NAD
水解提供的能量催化相邻的核苷酸分子间3'-羟

基和5'-磷酸基形成磷酸二酯键。

注：DNA 连接酶催化底物可以是DNA 或RNA。
依据酶的类型不同，反应中产生高能中间产物的辅助因子可以是

ATP 或 NAD+。

3.2

T4 DNA 连接酶 T4 DNA ligase

一种T4 噬菌体基因30的编码产物，以 ATP 作为辅助因子，催化双链 DNA 或
RNA 的5'-磷酸末

端和3'-羟基末端形成磷酸二酯键。

注：带有 His-Tag,分子质量约为70ku,来源于转化有T4DNA 连接酶表达载体的
E.Coli菌株。主要作用是催化

DNA 末端之间的连接，修复双链核酸中的单链切刻。

3.3

酶活力单位 unit activity

在20μL1×T4 DNA 连接酶反应缓冲液中，16℃反应条件下，30 min 能使50%的经
Hind Ⅲ 消

化的 λDNA 片段[5'端浓度为0.12 μmol/L(300
μg/mL)]连接所需的酶量即为1活力单位。

4 缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PCR 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)。

SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide gel

GB/T 34776—2017

electrophresis)。

Tris 三(羟甲基)氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)metyl aminomethane)。

5 试剂与溶液

除非另有规定，本方法所用的试剂应为不含DNA 和 DNase
的分析纯试剂，所有试剂溶液宜大体积
配制、小体积分装后经高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂应用0.22μm
过滤器过滤除菌；酶缓冲液

应避免反复冻融；水为GB/T 6682 规定的一级水。

5.1 氯化钠(NaCl)。

5.2 琼脂粉(Agar)。

5.3 氢氧化钠(NaOH)。

5.4 乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA,Ci₀H₁₄N₂O₈Na₂)。

5.5 TE 缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mmol/L EDTA,使用 HCl 或 NaOH
调节 pH。

5.6 酶贮存溶液：50 mmol/L KCl,10 mmol/L Tris-Cl(pH 7.4),0.1 mmol/L
EDTA,1 mmol/L DTT,200 μg/mL BSA 和50%的甘油。

5.7 10 XT4 DNA Ligase Buffer:400 mmol/L Tris-Cl,100 mmol/L MgCl₂,100
mmol/L DTT,

5 mmol/L ATP(pH7.8)。

5.8 50×TAE 缓冲液：称取484 gTris, 量取114.2 mL 冰乙酸，200 mL0.5 mol/L
EDTA(pH 8.0),溶 于水中，定容至2 L。

5.9 10×上样缓冲液：含0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF,30% 甘油水溶液。

6 主要仪器和设备

6.1 电泳系统：应符合 YY/T 0087 的要求。

6.2 凝胶成像系统。

6.3 加热制冷水浴/循环器： -20℃~100℃。

6.4 冷冻离心机：可以在4℃下进行离心，离心转速10000 r/min 以上，应符合
YY/T0657 的要求。

6.5 微量可调移液器：0.5μL～10μL,10μL～100μL,100μL～1000μL, 应符合JJG 646
的要求。

7 试验方法

7.1 酶活力测定

7.1.1 λ DNA-Hind Ⅲ 底物制备

λDNA-Hind Ⅲ按照以下步骤进行制备：

a)
按表1配制酶切反应体系。加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，

切忌振荡混匀);轻轻混匀，短暂离心。

表 1 酶切反应体系

GB/T 34776—2017

表 1(续)

b) 37℃ 反应4 h。
反应结束后向样品管中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1),轻轻
摇匀；12000 r/min 离心8 min。 小心地将上清转移到新 EP
管中，不应吸到下面有机相里的 液体。

c) 加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1),轻轻摇匀；12000 r/min 离心8 min。
小心地将上清转移 到新 EP 管中。

d) 加入1/10体积的3 mol/L
醋酸钠颠倒混匀，再加2倍以上体积的无水乙醇，颠倒充分混匀后
室温放置沉淀。

e) 用适量75%～80%乙醇清洗白色沉淀2次。

f) 放于超净台轻风将残余乙醇吹干，也可以室温蒸发。

g) 用适量的TE 缓冲液溶解 DNA。

h) 紫外分光光度计和琼脂糖电泳检测 DNA
浓度和纯度(电泳检测结果条带清晰明亮，无杂带， 范围分布在23130 bp～125
bp之间。紫外可见分光光度计测定产物的A₂6/A₂ 在1.8～1.9 之 间 ，A₂0/A₂
3o>2)。

7.1.2 T4 DNA 连接酶活力检测

按表2顺序配制20μL 连接反应体系，每个梯度设置3个平行。

表 2 酶活力测定反应体系

构建连接酶的阳性对照组和无酶阴性对照组。

加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，切忌振荡混匀);轻轻混匀，短暂
快速离心，在最适温度下(一般为16℃),反应30 min,进行电泳(电泳条件参见附录
A), 观察连接情

况；根据参照酶加入的最小体积乘以稀释倍数计算待测酶活力。具体计算方式可参见附录
A。

7.2 杂质检测

7.2.1 核酸内切酶检测

按表3顺序配制连接反应体系。

GB/T 34776—2017

表 3 核酸内切酶检测连接反应体系

加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，切忌振荡混匀);轻轻混匀，短暂
快速离心，在最适温度下(一般为37℃)连接4
h,连接产物进行电泳，根据电泳图谱，判断酶中是否夹杂

有核酸内切酶，如条带清晰、明显、不发生变化，说明无核酸内切酶污染。

7.2.2 核酸外切酶检测

7.2.2.1 单链外切脱氧核糖核酸酶检测

按表4顺序配制连接反应体系。

表 4 外切酶检测连接反应体系

加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，切忌振荡混匀);轻轻混匀，短暂
快速离心，在最适温度下(一般为30℃)连接过夜，反应产物经15% SDS-PAGE
电泳检测并成像分析

实验结果。无DNA 降解说明无单链外切脱氧核糖核酸酶的污染。

7.2.2.2 双链外切脱氧核糖核酸酶污染检测

按表5顺序配制连接反应体系。

表 5 外切酶检测连接反应体系

GB/T 34776—2017

加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，切忌振荡混匀);轻轻混匀，短暂
快速离心，在最适温度下(一般为37℃)孵育4 h,反应产物经15% SDS-PAGE
电泳检测并成像分析实

验结果。无DNA 降解说明无双链外切脱氧核糖核酸酶的污染。

7.2.3 核酸酶检测

按表6顺序配制连接反应体系。

表 6 核酸酶检测连接反应体系

轻轻混匀，短暂快速离心；最适温度下(一般为37℃)连接24 h 或18
h,连接产物进行电泳，带型不

发生变化。如果带型清晰、明显、无变化说明无其他可检测到的核酸酶污染。

7.2.4 连接效率检测

按表7顺序配制连接反应体系。

表 7 连接效率检测连接反应体系

轻轻混匀，短暂快速离心；最适温度下(一般为16℃~22℃)连接1
h,连接产物进行电泳，≥98%

的 λDNA- Hind Ⅲ 片段被连接或≥95% λDNA-Hae Ⅲ
片段被连接，如果带型清晰说明连接效率高。

7.2.5 连接-再切检测

按表8、表9顺序配制连接反应体系和酶切反应体系。

加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，切忌振荡混匀);轻轻混匀，短暂
离心在最适温度下(一般为16℃~22℃),反应1 h,进行电泳，然后回收连接后的DNA,
溶于内切酶缓

冲液中；按表9顺序配制酶切反应体系。

GB/T 34776—2017

表 8 连接反应体系

表 9 酶切反应体系

轻轻混匀，短暂离心，最适温度下(一般为37℃)酶切4
h,酶切产物进行电泳，如果能被内切酶再次
切割，表示识别序列恢复完全，3'和5'末端保持完整。通过以上结果，可以判断是否存在连接酶抑制剂

或磷酸酶以及核酸外切酶等杂质。

GB/T 34776—2017

附 录 A

(资料性附录)

T4 DNA 连接酶酶活力计算

A.1 酶连接产物凝胶电泳检测

取0.8 g 琼脂糖，于100 mL 电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭(10
mg/mL) 至终浓度为 0.5μg/mL,
制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μL～8μL
酶连接产物分 别和适量加样缓冲液混合，点样。9 V/cm
恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。紫外检测仪

下观察电泳结果并记录。

A.2 酶活力计算

style="width:11.68681in;height:4.95486in" />

图 A.1 待测酶活力检测电泳图谱

从图 A.1
可以看出，稀释1200倍的待测酶与稀释400倍的参考酶同一酶量的连接反应产物相同，
即酶活力相当。因参照酶活力为5
weiss/μL,计算稀释倍数后，得出待测酶的酶活力为15 weiss/μL,即

3000 CEU/μL。

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